15.37. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG Vi
POLYSACARID CỦA VẮC XIN THƯƠNG HÀN Vi POLYSACHARID
Nguyên lý
Xác
định hàm lượng Vi polysacarid
bằng phương pháp hoá miễn dịch thích hợp,
sử dụng polysacharid tinh
chế chuẩn làm mẫu chuẩn.
Sử
dụng phản ứng điện di miễn dịch rocket
để xác định hàm lượng Vi polysacharid trong vắc xin thương hàn Vi
Phương pháp tiến hành
Pha dung dịch đệm và thạch agarose
- Pha dung
dịch đệm barbital ½.
- Rót dung
dịch đệm barbital ½.
vào bể điện di.
- Pha
thạch agarose (0,5g thạch
agarose hoà vào 40 ml dung dịch
đệm bacbital ½), đun
cách thuỷ hoặc đun trên máy khuấy từ gia
nhiệt cho đến khi thạch tan chảy hoàn toàn.
- Để
thạch nguội đến khoảng 56oC, cho 1 ml
huyết thanh thỏ kháng Vi vào và lắc nhẹ tròn
đều chai thạch sao cho huyết thanh thỏ kháng Vi
hoà tan đều vào thạch nhưng không bị tạo
bọt.
Tạo bản gel và đục lỗ
thạch
- Đổ
thạch trên khuôn, chờ thạch nguội hoàn toàn.
- Đục
lỗ thạch bằng bộ đục lỗ chuyên
dụng sao cho các giếng trên bản gel phải cách mép
bản gel ít nhất 2 cm và cách nhau ít nhất 1cm. Số
lượng giếng trên bản gel phải được
tính toán sao cho có đủ 5 giếng cho các hàm lượng
kháng nguyên Vi chuẩn, 2
giếng (làm kép) cho mỗi mẫu thử.
Pha mẫu kháng nguyên Vi chuẩn
- Pha loãng
kháng nguyên Vi chuẩn bằng dung dịch PBS ở các độ pha loãng như sau: 100; 50; 25;
12,5; 6,25 µg Vi polysacharid /ml.
- Lần
lượt nhỏ mẫu chuẩn ở các độ pha
loãng như trên vào từng giếng trên bản gel
(5µl/giếng); cho vào 2 giếng tiếp theo mỗi giếng
5µl vắc xin mẫu thử.
Chạy điện di miễn dịch
Rocket
- Đặt bản gel vào máy
điện di theo hướng mẫu đi từ cực
âm sang cực dương.
- Bật
nguồn, cài đặt các thông số thích hợp về
hiệu điện thế, cường độ dòng
điện và thời gian chạy điện di của
mẫu.
- Dùng
giấy lọc Whatman làm cầu nối từ bể dung
dịch điện di tới bản gel ở cả 2
đầu bản gel.
- Bấm
nút ”Run” để chạy điện di
Rửa bản gel
- Sau khi chạy
điện di xong, tắt nguồn, lấy bản gel ra
khỏi máy điện di, cho vào hộp nhựa trong có
nắp kín.
- Cho
nước muối sinh lý ngập bản gel và ngâm, lắc
nhẹ bằng máy lắc trong 3 giờ (thay nước
muối sinh lý 1 giờ/lần).
- Hút
hết nước muối sinh lý ra và thay bằng
nước cất. Ngâm và lắc hộp nước
cất có chứa bản gel liên tục. Sau khi ngâm
được 1 giờ, thay nước cất 30 phút/
lần.
Ủ bản gel
- Đổ
toàn bộ nước cất ra khỏi hộp.
- Phủ
một lớp giấy lọc lên mặt bản gel
để tránh cho bản gel không bị khô không đồng
đều.
- Ủ
bản gel qua đêm trong tủ ấm 37 oC.
Nhuộm và tẩy bản gel
- Bóc
bỏ lớp giấy lọc trên mặt bản gel.
- Nhuộm
bản gel bằng dung dịch nhuộm màu trong 15 phút. Trong
quá trình nhuộm, lắc đều hộp dung dịch
nhuộm màu có chứa bản gel bằng máy lắc.
- Hút
bỏ toàn bộ dung dịch nhuộm màu và bơm dung
dịch tẩy màu vào hộp chứa bản gel; ngâm,
lắc liên tục cho đến khi nhìn rõ những cột
tên lửa trên bản gel. Nếu bản gel vẫn còn xanh
đậm, có thể thay dung dịch tẩy màu mới
nhằm rút ngắn thời gian tẩy màu của bản
gel.
Đọc và tính kết quả
- Bản
gel được đưa ra khỏi hộp nhựa và
đặt trên phiến kính trong.
- Dùng
thước đo chuyên dụng để đo chiều
cao các cột tên lửa trên bản gel, từ các giếng
kháng nguyên chuẩn và mẫu thử.
- Dựa
vào chiều cao các cột tên lửa, xây dựng
được đường chuẩn và tính kết
quả hàm lượng kháng nguyên Vi từ mẫu thử
bằng chương trình Excell
Đánh giá kết quả
- Loạt
vacxin thương hàn Vi polysacharid
được coi là đạt yêu cầu về chỉ
số hàm lượng Vi polysacarid
khi thử nghiệm có giá trị (valid) và đạt 35 – 65
µg polysacharid/ 0,5 ml vắc xin.
- Nếu
thử nghiệm xác định hàm lượng Vi polysacharid không có giá trị (invalid)
vì một lý do nào đó thì phải nhắc lại thử
nghiệm với số lượng mẫu bằng
lượng mẫu của lần kiểm tra thứ
nhất.
- Nếu
thử nghiệm xác định hàm lượng Vi polysacharid có giá trị (valid)
nhưng không đạt yêu cầu về hàm lượng
như quy định thì nhắc lại thử nghiệm
với số lượng mẫu gấp đôi. Ở lần
kiểm tra thứ hai nếu hàm lượng Vi polysacarid đạt yêu cầu
(nằm trong khoảng cho phép của tiêu chuẩn chấp
thuận thì loạt vắc xin đó được coi là
đạt yêu cầu về hàm lượng Vi polysacharid. Nếu kết
quả hàm lượng Vi polysacharid
không đạt yêu cầu thì loạt vacxin đó phải
huỷ bỏ, không được phép xuất xưởng
đưa vào sử dụng.
Tiêu chuẩn chấp thuận
(25 µg ±
30%) Vi polysacharid/ 0,5ml (1 liều đơn vắc xin dùng cho
người).